Achtergrond

Analytisch mosselfestijn

Nog altijd vormen mariene toxines een taaie uitdaging voor de vloeistofchromatografie. Wie ontwikkelt een handzame schelpdierentest?

‘Eindeloos methodes ontwikkelen totdat alles werkt’, zo vat Mirjam Klijnstra haar werk samen. Als onderzoeksprojectleider bij Wageningen Food Safety Research (voorheen RIKILT) is ze bezig met natuurlijke toxines aantonen, die worden gevormd door algen in mosselen, oesters en andere schelpdieren. Binnen Europa is het sinds een paar jaar verboden om daarvoor proefdieren te gebruiken. De combinatie van HPLC en MS geniet de voorkeur, temeer omdat die ook laat zien met welk toxine je precies te maken hebt. ‘Maar dat werkt nog niet voor alle toxines zoals we zouden willen.’

Twee LC-kolommen

Klijnstra legt uit dat mariene toxines sterk kunnen verschillen. Sommige zijn apolair, andere juist zeer polair. Een voorbeeld van die laatste categorie is tetrodotoxine, dat vooral bekend is uit Japanse kogelvissen. Sinds 2015 is het ook te vinden in de Oosterschelde. ‘Eerst ontdekten de Engelsen het in hun schelpdieren, tot hun grote verbazing. Toen zijn wij gaan meten en vonden het eveneens’, vertelt Klijnstra. Waar het vandaan komt, wordt nog onderzocht. Screenen op tetrodotoxine noemt ze redelijk te doen, omdat het om één specifiek molecuul gaat. ‘Maar met PSPs, die paralytic shellfish poisoning veroorzaken, ligt dat veel lastiger. Dat is een grote groep polaire toxines met veel analogen die verschillende functionele groepen hebben.’

Bij HILIC is de optimale gradiënt voor elk toxine anders

Dat je je schelpdierenextract moet verdelen over twee LC-kolommen, is haast onontkoombaar. Voor apolaire toxines is reversed phase-LC een prima keuze, maar de polaire varianten laten zich alleen redelijk scheiden met HILIC, wat staat voor hydrophilic interaction liquid chromatography. ‘En HILIC-methodes worden nooit zo mooi en strak’, weet Klijnstra.

In de ruis

HILIC combineert een polaire stationaire fase uit de hoek van de normal-phase LC met een mobiele fase die hoort bij reversed-phase: een combinatie van water en een apolair oplosmiddel, meestal acetonitril. ‘De gradiënt die je toepast, is echter precies omgekeerd’, legt Klijnstra uit. ‘Bij HILIC start je met zo veel mogelijk organisch oplosmiddel. Polaire componenten blijven dan plakken op de kolom, en komen weer vrij naarmate je het waterpercentage opvoert.’ En daarin schuilt het eerste probleem: schelpdieren extraheer je met een waterige oplossing. Voor de HILIC-scheiding moet daar minstens evenveel acetonitril bij. ‘Die verdunning is niet bevorderlijk voor de gevoeligheid’, weet Klijnstra. ‘Als we grote pieken hadden, was het geen probleem, maar we zitten soms toch al bijna in de ruis te werken.’

Ze voegt eraan toe dat bij HILIC de optimale gradiënt voor elk toxine anders is, wat het lastig maakt in een keer meerdere toxines tegelijk op te sporen. ‘En alle zouten in het sample zijn ook polair, en verstoren je scheiding heel erg. De piekvorm kan veranderen en de retentietijd verschuift van sample tot sample.’

Het maakt HILIC voorlopig alleen bruikbaar voor een eerste screening. Om de aanwezigheid van polaire toxines te bevestigen, schrijft de EU nu HPLC met fluorescentiedetectie voor. ‘Die procedure is complex en bewerkelijk. Maar HILIC is nog geen optie. De toxines komen er allemaal wel uit, maar kwantificeren zou ik niet aandurven.’

Of ze een verlanglijstje heeft voor fabrikanten van HILIC-kolommen? Klijnstra: ‘Het zou een uitkomst zijn als ze de analyse stabieler weten te maken en minder gevoelig voor de matrix. Ook de scheiding van analogen is soms best lastig.’

Agenda
Ontvang de nieuwsbrief

Meld je aan voor de nieuwsbrief en blijf op de hoogte van het laatste nieuws van C2W.

Meld je nu aan!

C2W Social Media

Logo Twitter

Logo Linkedin

Wordt abonnee/lid

Logo KNCV

Sluit nu een abonnement af of word lid van de KNCV en ontvang elke week het laatste nieuws, digitaal of op papier. 

Sluit nu een abonnement af!