De tijd van lukraak enzymen muteren en dan maar hopen dat er een actiever en stabieler enzym uitrolt om te gebruiken in de biokatalyse is voorbij. Ontwerpen en screenen met behulp van computeralgoritmes is sneller én effectiever.

‘Een paar jaar geleden was enzymontwerp met behulp van de computer echt nog een rariteit, maar inmiddels stijgt de populariteit ervan’, stelt Dick Janssen, hoogleraar chemische biotechnologie aan de Rijksuniversiteit Groningen. ‘En dat neemt alleen maar verder toe.’ Dat beaamt ook Henk Jan Joosten, ceo van Bio-Prodict, een bedrijf dat software ontwikkelt om onder meer eiwitten virtueel te ontwerpen en te screenen. ‘De mogelijk­heden worden beter en de voorspellingen nauwkeuriger. Mensen zien dat. Ons bedrijf groeit hard, er is veel vraag naar onze software.’

Traditioneel pas je bij enzymontwerp in het lab willekeurige mutagenese toe – ook wel directed evolution genoemd – op een van nature voorkomend enzym. Zo laat je de activiteit, stabiliteit en/of selectiviteit toenemen. ‘Er zijn al veel werkzame enzymen met die aanpak ontwikkeld’, zegt Janssen. ‘Heel terecht heeft Frances Arnold voor onderzoek op dit gebied in 2018 dan ook de Nobelprijs voor de Scheikunde gekregen. Er zijn echter beperkingen.’

Je moet bijvoorbeeld maar hopen dat er een goede mutant bij zit. ‘Het vergt vaak veel optimalisatierondes waarbij je een grote hoeveelheid mutaties moet meten’, zegt Joosten. ‘Een enorme tijdrovende klus. Door goede voorspellingen van computeralgoritmes kun je gerichter zoeken en daarmee die enorme hoeveelheid experimenten verkleinen.’

Computeralgoritmes om enzymen te ontwerpen kun je verdelen in twee soorten: de statistische methode en de biofysische methode. ‘Bij die eerste gebruik je grote hoeveelheden data om daarmee statistische correlaties of trends te vinden, en die te gebruiken om voorspellingen te doen voor je enzym’, legt Janssen uit. ‘Met de tweede benadering breng je de biofysische interacties binnen het enzym in kaart. Daar laat je vervolgens energieberekening-en op los om vast te stellen welke aminozuren wel of niet mogelijk zijn wat betreft binding en katalyse.’

Eiwitfamilies

Het bekendste programma dat werkt op basis van statistiek is 3DM. ‘De software analyseert eiwitfamilies’, zegt Joosten. ‘Het legt alle familieleden binnen een eiwitfamilie in sequentie onder elkaar. Zo zie je welke aminozuren weinig zijn veranderd in de loop der evolutie en dus essentieel zijn voor de werking van het enzym. Een bacterie die bijvoorbeeld bij 100 °C leeft, heeft heel stabiele enzymen. Met 3DM kun je uitvogelen welke mutaties daarvoor verantwoordelijk zijn. Je kunt die vervolgens proberen toe te passen op een niet zo stabiel enzym om het zo thermostabieler te maken. Datzelfde is mogelijk aan de hand van alle literatuurdata die ons programma verzamelt en analyseert voor een beoogd enzym.’

‘Met algoritmes kun je gerichter zoeken en het aantal experimenten verkleinen’

Bij de biofysische benadering is op dit moment de Rosetta-suite, ontwikkeld door de groep van David Baker in Seattle, de meest gebruikte tool. Dit programma werkt puur op de eiwitstructuur zelf. Je plukt de actieve site van een enzym dat sterk op jouw startenzym lijkt eruit en zet daarin het substraat dat moet worden omgezet bij de beoogde reactie. Vervolgens gaat Rosetta allerlei mutaties uitproberen om te kijken welke combinatie van aminozuren het substraat beter laat passen.

‘Wij gebruiken Rosetta en integreren dat in onze workflow met moleculaire dynamica’, vertelt Janssen. Met programma’s zoals Gromacs en Martini, grotendeels in Groningen ontwikkeld, kun je de beweging en de werking van eiwitten op korte tijdschaal simuleren. ‘Eerst maak je met behulp van de energieberekeningen van Rosetta een aantal primaire enzymontwerpen, die gemuteerd zijn ten opzichte van het origineel. Die varianten kun je voorspellen, maar dat geeft soms wel duizenden ontwerpen die zouden kunnen werken en dat is veel te veel. Vervolgens gebruiken we dus snelle MD-simulaties om die hoeveelheid mutanten verder in te perken.’

Het idee is dus dat je 3DM of Rosetta, of allebei, gebruikt om een voorselectie te maken. Je krijgt dan zogenoemde small but smart mutant libraries, dit in tegenstelling tot de enorme mutantenbibliotheken die gewone willekeurige mutagenese oplevert. Succesvolle varianten in de slimme bibliotheek kun je vervolgens verder muteren en screenen in het lab.

Beter dan startenzym

De Duitse hoogleraar Uwe Bornscheuer van Universität Greifswald toonde aan wat zo’n smart library kan. Hij maakte drie verschillende mutantenbibliotheken van een lever-esterase van het varken: een slimme, waarbij 3DM de meest gunstigste aminozuren heeft voorspeld, een slechte, met het tegenovergestelde van de meeste gunstige mutaties, en een willekeurige, met een mengsel van goede en slechte varianten. Joosten: ‘De slimme bibliotheek bleek bijna alleen maar mutanten te hebben die even goed en vaak zelfs beter zijn dan het startenzym.’

Een andere ontwikkeling die eraan gaat komen, is volgens Janssen de virtuele screening van grote collecties van enzymen, uit databases of een groot aantal mutanten. Dat gebeurt al veel voor kleine moleculen, zoals voor geneesmiddelenontwikkeling. Dan zoek je bijvoorbeeld een molecuul dat zou kunnen binden op een bepaalde receptor. ‘Maar in het geval van enzymontwerp zou je voor elk gegeven substraat alle mogelijke enzymen die het efficiënt omzetten kunnen vinden. Vervolgens kun je die enzymen maken en uittesten in het lab.’

‘Dit vakgebied hikt nog een beetje aan tegen het voorspellen van de activiteit’

In de meeste gevallen voorspellen de energieberekeningen nog vooral de stabiliteit en soms de selectiviteit van het beoogde enzym. ‘Met behulp van energieberekeningen en MD-simulaties hebben wij nu een stuk of zeven enzymen gemaakt die bij een veel hogere temperatuur werken, of organische oplosmiddelen heel goed tolereren en/of nog heel actief zijn bij zeer hoge substraatconcentraties’, zegt Janssen. ‘Maar waar dit vakgebied nog een beetje tegenaan zit te hikken, is het voorspellen van de activiteit, of reactiesnelheid, van een bepaalde reactie. Zoiets is lastig, omdat de omzetting zelf niet te simuleren is. Wij zijn nu bezig met kwantummechanische berekeningen om in de toekomst ook die reactiesnelheid te gaan verbeteren.’

Kunstmatige intelligentie

3DM bevat vaak wel data die je kunt gebruiken om een enzym actiever te maken. Joosten: ‘Veel van onze klanten zijn al in staat geweest om de activiteit van hun targetenzym te verhogen, zodat het toepasbaar is gemaakt voor de beoogde biotechnologische toepassing. Een mooi voorbeeld is een nieuw xylose-isomerase, een eiwit dat je gebruikt om bio-ethanol te produceren. Dit enzym is veel actiever en stabieler dan alle tot dan toe commercieel verkrijgbare varianten.’

Bio-Prodict zit niet stil. ‘Onze laatste ontwikkeling is dat we kunstmatige intelligentie toepassen op onze data’, zegt Joosten. ‘Er is wereldwijd geen enkel bedrijf dat zo veel gegevens verzamelt als wij. En wij denken dat er met behulp van kunstmatige intelligentie nog veel betere mutatievoorspellingen uit te halen zijn dan nu.’

Joosten denkt overigens niet dat we in de toekomst alleen nog maar enzymen met behulp van computeralgoritmes maken. ‘Een robot kan in het lab ook heel veel screenen, waarschijnlijk miljoenen mutanten op een dag. Die twee moet je mijns inziens naast elkaar gaan gebruiken om tot de beste resultaten te komen.’