Nieuws

RNA-bewakingsmechanisme live in beeld

Michelle Wijma |
Analyse & Labtechnologie, Celbiologie, Genetica & Sequencing

De eiwitvisualisatietechniek SunTag kan een nieuw trucje. Dankzij onderzoekers van het Utrechtse Hubrecht Institute kan de assay nonsense-mediated mRNA decay live visualiseren in individuele mRNA-moleculen van levende cellen, schrijven zij in Molecular Cell.

SunTag is een fluorescentie imaging techniek die voor moleculaire microscopie wordt gebruikt. Onderzoekers van de Tanenbaum-groep ontwikkelden SunTag al in 2014 en de assay heeft er nu een nieuwe functie bij. Tim Hoek, Deepak Khuperkar en collega-onderzoekers van het Hubrecht Institute in Utrecht, pasten de assay namelijk zo aan dat je er nonsense-mediated mRNA decay (NMD) mee kunt bestuderen. 

NMD is een mRNA-bewakingsmechanisme dat de kwaliteit van mRNA-moleculen controleert en defecte mRNA’s onklaar maakt. Om precies te zijn ‘zoekt’ NMD naar vroegtijdige stopcodons (PTC’s) in het mRNA die ontstaan door puntmutaties in het DNA. Eiwitten die ondanks zo’n nonsense mutatie toch geproduceerd worden zijn incompleet, misvormd en meestal niet functioneel. Onder andere de ziekte van Duchenne en taaislijmziekte kunnen op deze manier ontstaan. 

Huidige technieken zoals ‘snapshot’-analyses en analyses in bulk maken momentopnames van het NMD-proces in grote aantallen cellen. SunTag daarentegen visualiseert ‘live’ en is zo precies dat je de genexpressie in individuele moleculen kunt volgen. De fluorescentie is heel helder doordat de assay grote hoeveelheden fluorescente proteïnes aan de ribosomen koppelt tijdens de translatie, en aan het te bestuderen eiwit zelf.

De visualisatie gebeurt met spinning disk confocal microscopie. Het werkt als volgt: de onderzoekers introduceren een artificieel stuk DNA in de cel, waarvan het zogenoemde reporter mRNA ten eerste codeert voor SunTag-eiwitten, waaraan fluorescente antilichamen binden. Deze doen het te bestuderen eiwit-in-wording groen oplichten. Ten tweede bevat het reporter mRNA een groep binding sites die áchter het gemuteerde stopcodon zitten en die rood oplichten. Als NMD nog niet is geïnduceerd door de ribosomen, zitten de groene en rode markers nog met elkaar in hetzelfde complex. Dat zie je tijdens de genexpressie als een geelgroene kleur. Maar na NMD-inductie is het mRNA geknipt bij de PTC en separeren de kleuren, waardoor je groen en rood apart ziet. Zie ook de afbeeldingen, beide afkomstig uit de publicatie in Molecular Cell.

De onderzoekers gebruikten de ‘nieuwe’ SunTag vervolgens voor diverse experimenten, waarbij ze dankzij de live visualisering ook allerlei kinetiek konden meten. Eerdere studies zijn het bijvoorbeeld niet eens over de vraag of NMD vooral in de eerste translatieronde wordt geïnduceerd, of dat dit elke ronde kan gebeuren. Nu blijkt dat elk ribosoom een kans heeft om NMD te induceren. Hoe groot deze kans is, hangt af van de afstand tussen PTC en intron en van het aantal intronen. Daarnaast is er een bepaalde subpopulatie die aan NMD ontsnapt. 

‘Dankzij dit onderzoek weten we meer over de dynamiek van translatie, mRNA-stabiliteit en NMD’, zegt Tim Hoek, eerste auteur van de publicatie. ‘Deze nuance is wat onze kennis over genexpressie nodig heeft om het begrip over processen en ziektes uit te breiden. Maar naast NMD zijn er nog veel meer factoren die de genexpressie beïnvloeden op mRNA-niveau. Dit is nog maar het topje van de ijsberg.’

Deel deze pagina

Lableveranciers

Introducing the new Xevo TQ-GC

Consistent, high performance GC-MS/MS to surpass regulatory limits

Ontvang de nieuwsbrief

Meld je aan voor de nieuwsbrief en blijf op de hoogte van het laatste nieuws van C2W.

Meld je nu aan!

Word abonnee/lid

Sluit nu een abonnement af of word lid van de KNCV en ontvang elke week het laatste nieuws, digitaal of op papier. 

Sluit nu een abonnement af!

Naar boven